原位雜交原理：原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知順序核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交，從而對(duì)特定核酸順序進(jìn)行精確定量定位的過(guò)程。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進(jìn)行。原位雜交亦可以應(yīng)用于組織芯片的檢測(cè)。結(jié)果更豐富，更具有對(duì)比性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示：

實(shí)驗(yàn)流程：

　　1、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無(wú)水乙醇Ⅰ5min-無(wú)水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗。

　　2、消化：根據(jù)組織固定時(shí)間長(zhǎng)短，切片于修復(fù)液中煮沸10-15分鐘，自然冷卻。后基因筆畫圈，根據(jù)不同組織不同指標(biāo)特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20-30 min。純水沖洗后PBS洗3次×5min。

　　3、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：滴加3%甲醇-H2O2，室溫避光孵育15min，將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。

　　4、預(yù)雜交：滴加預(yù)雜交液，37°C孵育1h。

　　5、雜交：傾去預(yù)雜交液，滴加含探針雜交液, 恒溫箱 37度雜交過(guò)夜。

　　6、雜交后洗滌：洗去雜交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多，可以增加甲酰胺洗滌。

　　7、滴加封閉液：滴加封閉血清 BSA。室溫30min。

　　8、滴加鼠抗地高辛標(biāo)記過(guò)氧化物酶(anti-DIG-HRP)：傾去封閉液，滴加anti-DIG-HRP。37°C孵育40min，后PBS洗4次×5min。

　　9、DAB顯色：切片稍甩干后，在圈內(nèi)滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，陽(yáng)性為棕黃色，純水沖洗切片終止顯色。

　　10、復(fù)染細(xì)胞核：Harris蘇木素復(fù)染3min左右，自來(lái)水洗，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水洗，氨水返藍(lán)，流水沖洗。

　　11、脫水封片：將切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min—100%酒精I(xiàn) 6min—100%酒精I(xiàn)I 6min-正丁醇6min—二甲苯透明，將切片從二甲苯中拿出稍晾干后，中性樹膠封片。

　　15、顯微鏡檢，圖像采集分析。

結(jié)果判讀：

　　陽(yáng)性為棕黃色，細(xì)胞核為藍(lán)色。

送樣運(yùn)輸要求：

　　石蠟。標(biāo)本放原位雜交固定液中，常溫運(yùn)輸;芯片切片常溫運(yùn)輸。