糖尿病(diabetes mellitus ,DM)已成為嚴重危害人類健康的公共衛生問題。DM及其并發癥不僅嚴重影響糖尿病患者的生活質量,同時也是致殘、致死的重要原因。因此,建立合適的糖尿病動物模型,闡明DM及其并發癥的發病機制就顯得尤為重要。目前,DM動物模型制備方法主要有:手術切除胰腺、化學藥物誘導、自發性糖尿病動物模型、轉基因動物等。

一、切除胰腺的DM模型

常采用狗、貓和大鼠等造模,全部或大部分切除實驗動物的胰腺,但保存胰十二指腸動脈吻合弓。如果連續兩天血糖值超過11.1mmol/L或者葡萄糖耐量試驗120min時的血糖值仍未恢復到注射前水平則認為DM造模成功。其機制是全部或大部分切除胰腺后,β細胞缺失而產生永久性DM。

二、化學藥物誘發的DM模型

采用鏈脲佐菌素腹腔注射或四氧嘧啶靜脈注射可誘發DM,常用動物有小鼠、大鼠、家兔和狗。鏈脲佐菌素(streptozotocin STZ)的參考劑量為50～150mg/kg;四氧嘧啶(alloxan)的參考劑量為60～110mg/kg。

STZ是一種含亞硝基的化合物,進入體內可通過以下機制特異性地破壞胰島β細胞:

(1)STZ直接破壞胰島β細胞:主要見于注射大劑量STZ后。STZ注射后可引起β細胞內輔酶I(NAD)的濃度下降,NAD依賴性能量和蛋白質代謝停止,導致β細胞死亡;

(2)通過誘導一氧化氮(NO)的合成,破壞胰島β細胞;

(3)STZ激活自身免疫過程,進一步導致β細胞的損害:小劑量注射STZ可破壞少量胰島β細胞,死亡的胰島β細胞可作為抗原被巨噬細胞吞噬,產生TH1刺激因子,使TH1細胞系占優勢而產生IL-2及IFN-γ,在胰島局部促使炎性細胞浸潤,并活化釋放IL-1、TNF-α、IFN-γ、NO和H2O2等物質殺傷細胞。死亡細胞又可作為自身抗原,再次遞呈給抗原遞呈細胞進行處理,釋放細胞因子,放大細胞損傷效應,最終誘發DM。

四氧嘧啶進入體內后能迅速被胰島β細胞攝取,影響細胞膜的通透性和細胞內ATP的產生,抑制葡萄糖介導的胰島素分泌。四氧嘧啶主要通過產生氧自由基破壞β細胞結構,導致細胞的損傷及壞死,從而阻礙胰島素的分泌,使血清胰島素水平降低。因為四氧嘧啶導致糖尿病的同時也造成肝、腎組織中毒性損害并且部分采用四氧嘧啶制造的DM動物模型可自發緩解,因此目前已經很少應用。

三、自發性糖尿病動物模型

該模型絕大多數采用有自發性DM傾向的近交系純種動物,如BB(Biobreeding)鼠、NOD(non-obesity diabetes)小鼠、G(Goto-kakisaki)鼠和中國地鼠(chinese hamster)等動物造模。自發性DM動物模型是指動物未經過任何有意識的人工處置,在自然情況下發生DM的動物模型。已用于研究的自發性DM動物約有20種,可分為兩類:一類為缺乏胰島素,起病快、癥狀明顯,并伴有酮癥酸中毒,如BB(Biobreeding)鼠、NOD(non-obesity diabetes)小鼠和LETL大鼠,它們可以作為1型DM的動物模型使用。這些動物沒有肥胖,發病之初呈現胰腺炎的癥狀,人類組織相關性抗原(MHC)參與發病過程,這些都與人1型DM的特征相似。利用這些模型可以對人1型DM的發病機制進行深入研究;另一類為胰島素抵抗性高血糖癥,其特點是病程長,不發生酮癥酸中毒,為2型DM動物模型。常用的2型DM自發性動物模型有中國地鼠(Chinese hamster)、GK(Goto-Kakisaki Wistar rats)大鼠、NSY (Nagoya-Shibata-Yasuda) 鼠和OLETF大鼠。

(一)1型糖尿病動物模型

1、BB大鼠

BB鼠是常用的1型DM模型動物,是由加拿大渥太華Biobreeding實驗室培育而成。大約50%～80%BB鼠可發生DM,雄性與雌性大鼠發病率相當。BB大鼠一般于60～120日齡時發生DM,發病前數天可見糖耐量異常及胰島炎。發病的大鼠具有1型DM的典型特征:體重減輕、多飲、多尿、糖尿、酮癥酸中毒、高血糖、低胰島素、胰島炎、胰島β細胞減少,需依賴于胰島素治療才能生存。BB大鼠另一個特點是其血液中淋巴細胞減少,易于感染。此外,BB大鼠發生淋巴細胞甲狀腺炎的頻率較高,其血清常可檢測出抗平滑肌、骨骼肌、抗壁細胞和抗甲狀腺球蛋白的自身抗體。

2、NOD小鼠

NOD小鼠為一種自發性非肥胖DM小鼠,其發病年齡和發病率有著較為明顯的性別差異,雌鼠發病年齡較雄鼠明顯提早,發病率亦遠高于雄鼠,NOD小鼠3-5周齡時開始出現胰島炎,浸潤胰島的淋巴細胞常為CD4+或CD8+淋巴細胞,于13～30周齡時發生明顯DM。與BB大鼠不同的是,NOD小鼠一般不出現酮癥酸中毒,無外周血淋巴細胞減少,但同樣需要胰島素治療以維持生存。在NOD鼠胰島炎初期,血漿和胰島灌注液中胰島素的基礎值和對葡萄糖的反應值均減低,同時胰高血糖素和胰高血糖素樣物質的免疫活性增加,NOD小鼠葡萄糖激酶、丙酮酸激酶等活性下降,葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和丙酮酸激酶的活性增加,肝組織中轉氨酶、乳酸脫氫酶、支鏈氨基酸以及腎臟組織中的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、α-葡萄糖苷酶和α-甘露糖苷酶等活性也均降低。NOD小鼠伴發DM是遺傳、免疫和自由基損傷多因素綜合作用的結果,NOD小鼠這些特點與1型DM患者相似,是研究關于1型DM遺傳學、免疫學、病毒學特征及其預防和治療等方面的良好動物模型。

3、 LETL(long evans tukushima lean)大鼠

LETL也是一種1型DM模型的動物,通常于8～20周齡時發生DM,雄性大鼠發病率約為21%,雌性大鼠發病率約為15%,如果在5～7周齡時使用環磷酰胺處理大鼠則其在16周齡時,DM發病率增加一倍。LETL大鼠無外周血淋巴細胞減少,在明顯DM癥狀發生前4～5天,胰島可見有明顯的淋巴細胞浸潤。

(二)2型糖尿病動物模型

1、嗜沙肥鼠(Psammonys Obesus,PO)

PO大鼠是生活在沙漠地區的嚙齒類動物,該鼠具有明顯的胰島素抵抗,在高熱量飲食條件下(數天～兩周),90% 的PO大鼠可自發出現高胰島素血癥,并伴有明顯的高血糖,隨后出現胰島素水平降低。PO大鼠的DM發病大致可分為以下四個階段:①起始階段:該階段內血糖及血清胰島素水平均正常;②高胰島素血癥期:該期血糖仍保持正常,但血清胰島素明顯升高;③高胰島素和高血糖期:該期內血糖>11.1mmol/L;④低胰島素高血糖期:該期由于胰島β細胞分泌功能損害導致低胰島素和高血糖,大鼠需應用胰島素治療以維持生存。Duhault等發現PO大鼠在2型DM晚期呈胰島素依賴性,胰腺組織學顯示有胰島炎存在,說明其具有遲發1型DM(Latent autoimmune diabetes mellitus in adult,LADA)的特點,故PO大鼠可能適用于LADA的研究。

2、中國地鼠

自發性DM地鼠模型是將健康的中國地鼠通過近親繁殖而獲得。這種模型以輕、中度高血糖為特征,動物為非肥胖型,血清胰島素表現多樣,胰島病變程度不一,類似于人類的2型DM。多數地鼠DM發病在1歲齡以內,群體發病率約為20.88%。

3、 GK大鼠(Goto-Kakisaki Wistar Rats)

GK大鼠是一個常用的自發性非肥胖2型DM模型動物,GK雌、雄鼠發病率相當,一般于3～4周齡時發生明顯的DM。在高血糖發生前,常有一段血糖正常時期(從出生后到斷奶),相當于人類的DM前期。其特征有:葡萄糖刺激的胰島素分泌受損,β細胞數目減少60%,肝臟對胰島素的敏感性降低,導致肝糖生成過多;肌肉和脂肪組織呈中度胰島素抵抗。GK大鼠血壓也較正常wistar大鼠高(低鹽攝入約高15mmHg,高鹽攝入約高24mmHg)。此外,GK大鼠具有與人類2型DM微血管并發癥相似的改變如運動神經傳導速率減慢、神經纖維有節段性脫髓鞘、軸突變性、視網膜血管內皮生長因子(VEGF)表達增加、視網膜局部血流減少、白蛋白尿、腎小球基底膜增厚、腎小球肥大和硬化等。

4 、Zucker DM肥胖(zucker diabetic fatty,ZDF )大鼠

ZDF大鼠是常用的2型DM模型動物,該鼠由于瘦素受體突變導致多食、肥胖同時伴有高胰島素血癥、高脂血癥和中度高血壓。雄性ZDF大鼠一般于8～10周出現DM,有DM的典型癥狀如多飲、多尿和體重增加緩慢,并可出現神經病變。雄性ZDF大鼠肌肉GLUT4表達明顯降低,其胰島β細胞GLUT2表達也明顯下調,這可能是ZDF大鼠發生2型糖尿病的機制。組織學研究發現,6周齡大鼠胰島即表現有結構紊亂和纖維化、胰島β細胞脫顆粒現象,同時胰島β細胞數量遠低于相同周齡的非DM ZDF大鼠。

5 、NSY(Nagoya-Shibata-Yasuda)小鼠

NSY小鼠是從jcl ICR遠交系小鼠根據葡萄糖耐量選擇繁殖產生的,具有年齡依賴性自發發生DM的特征。該鼠在任何年齡都無嚴重的肥胖,也無很高水平的高胰島素血癥,但在第24周齡出現顯著的葡萄糖刺激的胰島素分泌功能的減弱。病理學上未見胰島增生或炎性改變等形態學異常,提示NSY小鼠發生2型DM的原因可能是胰島β細胞對葡萄糖誘發的胰島素分泌功能改變。胰島素抵抗可能在其發病機理中發揮一定的作用。NSY小鼠將有助于人們對2型DM遺傳學傾向及病理發生的進一步研究。

6、 OLETF(Ostuka Long-Evans Tokushima Fatty)大鼠

OLETF大鼠是河野等利用Long-Evans系大鼠建立的自發性2型DM模型動物。該鼠由于膽囊收縮素(CCK)-A受體mRNA的表達完全缺失,導致其食欲亢進和肥胖,消化道對CCK-8刺激無反應,胰腺的內、外分泌功能均降低。此模型具有2型DM的特征如多食、肥胖、多飲和多尿,能緩慢地自然產生2型DM。OLETF大鼠自8周齡起血清甘油三酯、膽固醇和餐后血糖均明顯高于對照鼠,隨著年齡的增長,血清甘油三酯和餐后血糖不斷升高。12周齡起出現明顯的胰島素抵抗;18周齡時,胰島素敏感性約為對照組的20%;24周齡時,血漿胰島素代償性增加;30周齡時,血TG水平達到對照組的5倍;40周齡以后,胰島的分泌功能降低;65周以后,血糖值高達25mmol/L,而免疫反應性胰島素(IRI)水平卻低于40pmol/L。OLETF大鼠尿蛋白自30周齡起明顯增多,且隨年齡的增加而迅速增加,雄性鼠55周齡時,尿蛋白含量可達800mg/d以上。組織學研究發現,OLETF大鼠胰腺呈進行性纖維化。20周齡時,胰腺即有明顯的纖維化、胰島增大;40周齡時,胰島被結締組織取代;70周齡時,胰腺極度萎縮,胰腺組織被脂肪和結締組織代替。此外,OLETF大鼠在22周齡時,即可出現腎小球基底膜增厚;40周齡以后,雄性OLETF大鼠腎小球增大,腎小球膜基質增生及腎小球基底膜增厚;70周齡時,幾乎在每一個腎小球周圍都可見被擴張的毛細血管包圍的PAS-陽性結節,這種結節性的改變膨脹到腎小球膜基質,OLETF大鼠的腎臟變化很類似人的DM結節性腎小球硬化癥。以上胰腺和腎臟不同階段的病理變化,與臨床2型DM患者的病理表現極為相似,為研究2型DM及其并發癥的發病機制和胰島素抵抗干預措施的評價提供了良好的實驗動物模型。

7 、db/db小鼠

db/db小鼠糖尿病發病系瘦素受體突變所致,呈常染色體隱性遺傳。 該鼠在10～14日齡時就出現多食、高胰島素血癥,但4周齡時血糖仍維持正常,隨后該鼠體重逐漸增加,出現高血糖。2～3月齡時盡管胰島素水平為正常時的6～10倍,但血糖水平可達22～33mmol/L。約3～6月齡時胰島素水平逐漸下降至低于正常水平,該期小鼠體重明顯下降,并出現酮癥,組織學顯示顯著的β細胞壞死,如缺乏胰島素治療,該小鼠存活不超過10月。db/db小鼠另一個特點為:其血清胰高糖素的水平較正常對照升高2倍以上。db/db小鼠是適用于研究2型糖尿病發病機制的動物模型。

8、 ob/ob小鼠

ob/ob小鼠為2型糖尿病模型動物,屬常染色體隱性遺傳。ob/ob小鼠糖尿病發病是由于ob基因突變,造成其編碼的蛋白leptin缺乏,引起肝脂肪生成和肝糖原異生顯著增加,高血糖又刺激胰島素分泌,引起胰島素抵抗,刺激脂肪的形成。ob/ob小鼠體重可達90克之多。ob/ob小鼠癥狀的輕重取決于遺傳背景。純合體動物表現為肥胖,明顯的高血糖及高胰島素血癥。ob/ob/6J小鼠胰島素水平可達正常小鼠的10～50倍,但其血糖常只有輕度的升高。組織學顯示ob/ob小鼠胰島β細胞顯著增生、肥大,而胰島A細胞、D細胞及PP細胞數量明顯減少。

9 、KK鼠

KK小鼠是一種輕度肥胖型2型糖尿病動物,它與C57BL/6J小鼠雜交,并進行近親繁殖,得到Toronto-KK(T-KK)小鼠。將黃色肥胖基因(即Ay)轉至KK小鼠,KKAy鼠,與KK小鼠相比,KKAy鼠有明顯的肥胖和糖尿病癥狀。KK小鼠有明顯的多食,從5周齡起血糖、血胰島素水平逐步升高,至5月齡時體重可達50克,非空腹血糖常低于17mmol/L,非空腹血胰島素可達1200ug/mL;1歲齡時多食、高血糖、高胰島素血癥、肥胖及肝臟對胰島素的敏感性可自發恢復正常,但糖尿病KK小鼠生命常明顯縮短。此外,KK小鼠空腹胰高糖素水平升高,且不受葡萄糖抑制。組織學顯示β細胞有脫顆粒和糖原浸潤,隨后出現胰島肥大和肝脂肪化和脂肪組織增多。

四、其他DM動物模型

(一)激素性DM動物模型:注射垂體前葉提取物、生長素、腎上腺皮質激素、甲狀腺素或胰高血糖素均可直接或間接產生DM。

(二)病毒性DM動物模型:利用腦-心肌炎病毒(EMC-M病毒)和柯薩基病毒等使某些種屬的小鼠胰島β細胞脫顆粒、壞死,導致胰島β細胞破壞,產生類似的1型DM。

(三)免疫性DM動物模型:靜脈注射抗胰島素抗體或用同種或異種胰島素的弗氏佐劑復合物及抗血清免疫;或用同種或異種胰腺+弗氏佐劑免疫動物均可在數小時后產生一過性高血糖。其機制是內源性胰島素與輸入的抗體結合導致內源性胰島素降低而致DM。

(四)下丘腦性DM動物模型:用電凝法或注射硫代葡萄糖金損傷丘腦下部腹內側核(VMH)飽中樞,可使成熟動物產生過度攝食、肥胖,直至產生DM。

五、轉基因糖尿病動物模型

轉基因動物(transgenic animal)技術是通過遺傳工程的手段對動物基因組的結構或組成進行人為的修飾或改造,并通過相應的動物育種技術使得這些經修飾改造后的基因組在世代間得以傳遞和表現。利用這一技術,人們可以在動物基因組的特定位點引入所設計的基因突變,模擬造成人類遺傳性疾病的基因結構或數量異常。可以通過對基因結構進行修飾,在動物發生、發育的全過程中研究體內基因的功能及其結構功能的關系。有關1型、2型DM和青少年發病的成人型糖尿病(maturity-onset diabetes of youth,MODY)的轉基因DM動物均有報道。

(一)MKR小鼠動物模型

MKR小鼠是由Fernández等培育出的2型DM轉基因動物模型。該小鼠骨骼肌過度表達失活的IGF-1受體,失活的IGF-1受體與內源性IGF-1受體及胰島素受體形成雜合受體,干擾這些受體的正常功能,導致明顯胰島素抵抗。該小鼠2周齡即有明顯的的高胰島素血癥,5周齡后空腹及進食后血糖逐漸升高,7～12周齡即有明顯糖耐量異常。PPAR- 激動劑 WY14、643治療可糾正MKR小鼠糖代謝異常。

(二)MODY2動物模型

zhang等利用基因敲除技術制得肝臟葡萄糖激酶(GCK) -小鼠,發現隨著時間延長,該鼠血糖逐漸升高,糖耐量減退,6周齡小鼠空腹血糖顯著高于對照組小鼠,這種肝細胞GCK活性減退所引起的疾病與人MODY相似,可作為MODY的動物模型。

(三)線粒體糖尿病

Silva等發現β細胞Tfam(mitochondrial transcriptionfactor A)突變的小鼠,大約5周齡時發生糖尿病,表現為嚴重mtDNA耗竭,氧化磷酸化不足和7~9周時胰島內可觀察到異常的線粒體,呈現線粒體糖尿病的改變。

(四)GDM(妊娠糖尿病)模型

妊娠期胰島素抵抗可引起妊娠糖尿病,患者胎兒典型特征是巨大兒,成年后患肥胖和2型糖尿的概率上升。Yama***a等發現雜合體C57BL/PKsJ-db/+小鼠發生GDM。妊娠引起PI3K與IRS-1解離,與IR結合活性增加,胰島素介導的精氨酸磷酸化增多而IRS-1表達及其酪氨酸磷酸化減少從而使IRS-1結合及激活PI3K能力下降,胰島素功能不能發揮,出現胰島素抵抗[。

(五)為了研究B淋巴細胞在1型DM發病中的作用,Wong等利用轉基因技術制得了NOD-RIP-B7-1(Nonobese Diabetic-Rat Insulin Promoter-B7-1)轉基因小鼠,該小鼠由于過度表達輔助刺激因子B7.1而致DM發病時間較正常NOD小鼠明顯提前,在12周齡即發生DM。

隨著對DM研究的逐步深入,相應的DM動物模型發展勢在必然,轉基因動物的建立將為DM研究提供更科學有效的工具。