雙螢(熒)光素酶檢測(cè)服務(wù)

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

螢（熒）光素（Luciferase）是自然界中能夠產(chǎn)生生物發(fā)光的酶的統(tǒng)稱，其中最有代表性的是來(lái)自螢火蟲(chóng)體內(nèi)(Fire?y)和海腎(Renilla)體內(nèi)的兩類螢光素酶，分別命名為F-Luciferase和R-Luciferase。在熒光素酶的催化下，熒光素底物可以高效的轉(zhuǎn)變成氧螢光素，同時(shí)發(fā)出強(qiáng)烈的光。

鑒于此，研究者利用熒光素酶開(kāi)發(fā)出一套極其靈敏且使用方便的基因報(bào)告系統(tǒng)。目前這一系統(tǒng)被廣泛用于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)與啟動(dòng)子活性分析、RNA降解、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、藥物篩選、動(dòng)物活體成像等領(lǐng)域。

服務(wù)推薦

●　轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)與啟動(dòng)子活性分析

●　miRNA靶基因驗(yàn)證

●　lncRNA吸附miRNA驗(yàn)證

●　circRNA吸附miRNA驗(yàn)證

●　專業(yè)的實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

技術(shù)特點(diǎn)

●　強(qiáng)大的學(xué)術(shù)支持團(tuán)隊(duì)協(xié)助設(shè)計(jì)科學(xué)合理的實(shí)驗(yàn)方案

●　極簡(jiǎn)的HB-infusion無(wú)縫克隆策略極大縮減載體構(gòu)建周期

●　高效的LipoFiter轉(zhuǎn)染試劑和病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，確保結(jié)果穩(wěn)定和可重復(fù)性

●　詳細(xì)的原始數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，確保結(jié)論清晰可靠

兩種常用載體類型極其應(yīng)用場(chǎng)景

●　pGL3-Basic---用于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)與啟動(dòng)子活性分析。把待分析啟動(dòng)子區(qū)段構(gòu)建到F-Luciferase上游，和轉(zhuǎn)錄因子共轉(zhuǎn)染分析F-Luciferase活性即可反應(yīng)啟動(dòng)子的活性高低。該質(zhì)粒通常需要結(jié)合持續(xù)性表達(dá)R-Luciferase的載體作為內(nèi)參以校正不同樣品之間轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染效率(參考案例一)。

●　psiCHECK2---miRNA與其靶點(diǎn)相關(guān)分析,包括miRNA靶基因驗(yàn)證(參考案例二A和B)、lncRNA (參考案例三)與circRNA (參考案例四)吸附miRNA驗(yàn)證等。需要把miRNA潛在結(jié)合靶點(diǎn)克隆到R-Luciferase (hRLuc) 3’UTR區(qū)域，然后與待測(cè)miRNA共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)測(cè)定R-Luciferase活性高低，F(xiàn)-Luciferase （hLuc+）作為校正內(nèi)參校正不同樣品之間轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染效率。

技術(shù)路線

經(jīng)典應(yīng)用案例1

●　LncRNA轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)與啟動(dòng)子活性分析

論文來(lái)源: Wang, P., et al. (2014). "The STAT3-binding long noncoding RNA lnc-DC controls human dendritic cell differentiation." Science 344(6181): 310-313.

本文是曹雪濤實(shí)驗(yàn)室在2014年發(fā)表在Science上一篇研究性論文。作者通過(guò)芯片鑒定出DC (樹(shù)突狀細(xì)胞)發(fā)育相關(guān)的一個(gè)lncRNA，命名為lnc-DC。同時(shí)高通量測(cè)序也發(fā)現(xiàn)了這條差異lncRNA的存在。進(jìn)而作者通過(guò)Northern Blot驗(yàn)證了這條lnc-DC。由于lnc-DC極其特異和穩(wěn)定地高表達(dá)在DC發(fā)育過(guò)程的某一時(shí)期，所以作者假設(shè)lnc-DC可能是和表觀遺傳學(xué)調(diào)控事件相關(guān)的。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者通過(guò)染色體免疫沉淀結(jié)合測(cè)序的技術(shù)-CHIP-seq和qPCR發(fā)現(xiàn)lnc-DC的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）附近富集了Pol II、H3K4me3和H3K27ac等蛋白，提示DC發(fā)育過(guò)程中表觀遺傳學(xué)變化與lnc-DC的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)事件相對(duì)應(yīng)。進(jìn)而作者通過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn)在lnc-DC的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近（+44-+50）存在一個(gè)經(jīng)典的PU.1結(jié)合位點(diǎn)。作者假設(shè)PU.1參與了lnc-DC的特異性表達(dá)。于是作者設(shè)計(jì)了如下實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證。

作者把lnc-DC的啟動(dòng)子區(qū)段（-1447-+223）及其不同的突變體版本分別克隆到F-Luciferase表達(dá)框上游，然后和轉(zhuǎn)錄因子PU.1表達(dá)質(zhì)粒或者空載體（Vector）共同轉(zhuǎn)染到模式細(xì)胞系HEK-293T，通過(guò)測(cè)量熒光強(qiáng)度的變化間接反應(yīng)轉(zhuǎn)錄活性的高低。最終證明轉(zhuǎn)錄因子PU.1通過(guò)經(jīng)典結(jié)合位點(diǎn)（+44-+50）介導(dǎo)了lnc-DC在DC發(fā)育過(guò)程中的特異表達(dá)。

經(jīng)典應(yīng)用案例2

●　LncRNA通過(guò)吸附miRNA調(diào)控靶基因mRNA的表達(dá) (ceRNA)

論文來(lái)源: Cesana, M., et al. (2011). "A long noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA." Cell 147(2): 358-369.

作者通過(guò)表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)了一條肌肉發(fā)育相關(guān)的lncRNA---lnc-MD1.前期功能研究發(fā)現(xiàn)lnc-MD1可以調(diào)控肌肉分化的時(shí)間。信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這條肌肉特異的lncRNA上包含36個(gè)miRNA的結(jié)合位點(diǎn)。如果只考慮肌肉發(fā)育相關(guān)的miRNA和基因，36個(gè)候選miRNA里面只剩下miR-133和miR-135。作者通過(guò)熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。首先作者把野生型及其缺失miR-133和miR-135結(jié)合位點(diǎn)的Lnc-DC1克隆到進(jìn)R-Luc的3’UTR，然后分別與表達(dá)miR-133和miR-135前體的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染到細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。證明lnc-MD1缺失存在miR-133和miR-135的結(jié)合位點(diǎn)。

進(jìn)一步的信息學(xué)預(yù)測(cè)，miR-133和miR-135分別靶向兩個(gè)基因- MAML1 和 MEF2C。同樣，作者還是通過(guò)熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。研究者把MAML1 和 MEF2C的3’UTR （WT）和miRNA結(jié)合位點(diǎn)缺失突變體（-mut）分別克隆在RLuc表達(dá)框的下游，然后和miRNA過(guò)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行酶活測(cè)定。結(jié)果顯示miR-133和miR-135確實(shí)分別靶向了MAML1 和 MEF2C兩個(gè)基因。最后的模型是lnc-MD1通過(guò)ceRNA機(jī)制吸附miR-133和135，正向調(diào)控了MAML1 和 MEF2C的表達(dá)，參與調(diào)控肌肉發(fā)育。